مقالات

برای انجام qRT-PCR جهت تکثیر MicroRNA از چه کنترل های داخلی باید استفاده کنیم؟

برای انجام qRT-PCR جهت تکثیر مولکول‌های MicroRNA از چه کنترل های داخلی باید استفاده کنیم؟

زمانی که قصد دارید با روش qRT-PCR، مولکول‌های MicroRNA را ارزیابی کنید، کنترل داخلی شما نیز باید یک RNA غیررمزگران باشد و البته نیازی نیست که حتماً این کنترل داخلی، MicroRNA باشد. در حقیقت، MicroRNAها با توجه به فلسفه وجودی و نقش تنظیمی شان در سلول، عملکرد شبیه به ژن‌های خانه‌دار (housekeeping genes) ندارند و معدود مطالعاتی که از مولکول‌های MicroRNA به عنوان کنترل داخلی استفاده می‌کنند، کار درستی نیست، اما در موارد معدودی مشاهده شده است که برخی MicroRNAها می‌توانند به عنوان کنترل داخلی در هنگام ارزیابی بیان MicroRNAها در وزیکولهای خارج سلولی نظیر اگزوزوم ها عمل کنند، چرا که گزینه بهتر و دیگری وجود ندارد. به طور کلی، کنترل داخلی به عاملی سلولی می‌گویند که مقدار آن تحت شرایط مختلف تغییر نمی‌کند یا تغییر ناچیزی نشان می‌دهد.

و اما کنترل داخلی برای ارزیابی بیان MicroRNAها!
یکی از پرتکرارترین کنترل‌های داخلی برای ارزیابی بیان MicroRNAها، رونوشت U6 است که یک snRNA غنی از یوراسیل (U) موجود در کمپلکس اسپلایسیوزوم است. کنترل‌های داخلی گاها بهتری هم پیشنهاد می‌شوند که از آن جمله می‌توان به snoRNAها اشاره کرد. فهرست بلندتری از کنترل‌های داخلی را می‌توان با مراجعه به وبسایت شرکت ABI برای نمونه‌های موشی و انسانی و غیره به دست آورد.

 

برخی از دانشجویان و همکاران تصور می‌کنند که چون MicroRNA مدنظرشان در qRT-PCR خیلی دیر بالا آمده، پس احتمالا کارشان مشکلی داشته!
خیر عزیزان، مولکول‌های MicroRNA درصد بسیار کوچکی از RNAهای سلول هستند و اصلا تعجبی ندارد که پلات تکثیری آنها در دستگاه real time PCR مقداری دیر بالا بیاید.
شما می‌توانید حداکثر Ct خود را برای تکثیر مولکول‌های MicroRNA روی ۴۵ بگذارید.
همچنین طبیعی است که بیان کنترل داخلی، بسیار بالاتر از MicroRNA موردنظر شما باشد، چون مولکول‌هایی که به عنوان کنترل داخلی انتخاب و استفاده می‌شوند، معمولاً از جمله ژن‌های خانه‌دار و فراوان در سلول هستند که البته برای این که بتوانند به عنوان کنترل داخلی ایفای نقش کنند، باید بیانشان تحت شرایط مختلف، چندان دستخوش تغییر نشود.

 

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *