اساس بررسی آپوپتوز یا مرگ برنامه ریزی شده سلولی توسط روش اتصال انکسین-V و رنگ آمیزی زیستی با PI یا سایر رنگ های فلورسانت چیست؟
در سلولهای سالم انکسین-V به طور اختصاصی به فسفاتیدیل سرین (PS) موجود در لایه داخلی غشای پلاسمایی اتصال می یابد. اما پس از شروع اپوپتوز PS سریعا جابه جا شده و در غشاء خارجی سلول مستقر می شود و در تشخیص سلول های آپوپتوتیک توسط ماکروفاژها بسیار حائز اهمیت می باشد. سلولهای آپوپتوز شده مورد فاگوسیتوز سریع قرار می گیرند.
اتصال انکسین-V به PS وابسته به کلسیم می باشد، بنابراین یک بافر واکنش دهنده حاوی کلسیم در طول اتصال مورد نیز می باشد. در غلضتهای پایین PS انکسین-V به نسبت ۸ به یک به PS اتصال می یابد و این فرایند یک فرصت ایده آل را جهت تشخیص تغییرات غشاء سلولی مرتبط با مراحل اولیه آپوپتوز، در مراحل بعدی آپوپتوز و حتی نکروز که تمامیت غشاء از بین می رود فراهم می کند. انکسین-V در غشاء داخلی به PS متصل می شود.
کیت انکسین-V شرکت MabTag حاوی رنگهای حیاتی از جمله PI می باشد. این رنگ تنها وارد سلولهایی می شود که ساختار غشاء پلاسمایی آنها از بین رفته باشد و بنابراین این امکان را فراهم می سازد که سلولهایی را که در مراحل اولیه آپوپتوز (َAnnexin ν+/PI) هستند از سلولهایی که در مراحل نهایی آپوپتوز هستند تمایز دهیم. سلولها به مدت ۳۰ دقیقه در معرض نور UV قرار می گیرند، پس از ۴ ساعت انکوباسیون، سلولها طی مراحلی که در ذیل آمده به ترتیب رنگ آمیزی می شوند.
۱- سلولهای زنده و سالم (–)
۲- سلولهای آپوپتوتیک اولیه (PI-/Annnexin-ν+)
۳- سلولهای کاملا آپوپتوتیک یا نکروز شده (++)