مقالات

آنتی بادی های ثانویه یک ابزار تحقیق قدرتمند – راهنمای انتخاب آنتی بادی

چگونه بهترین آنتی بادی ثانویه را انتخاب کنید؟

آنتی بادی های ثانویه یک ابزار تحقیق قدرتمند هستند. آن ها با کیفیت بالا شما را قادر به هدفگیری، شناسایی و تخلیص پروتئین ها با دقت بیشتری در طیف وسیعی از روش های بررسی پروتئین ها می کنند. آنتی بادی های ثانویه ما می تواند به صورت غیرکنژوگه یا کنژوگه به آنزیم ها و فلوئوروفورها برای کمک به تشخیص با استفاده از تکنیک هایی مانند وسترن بلات، ایمونوهیستوشیمی، ایمونوفلوئورسانس و ELISA عرضه شوند.

مزایای استفاده از آنتی بادی های ثانویه:

۱٫ حساسیت پیشرفته
۲٫ افزایش دقت
۳٫ انعطاف پذیری بیشتر در انتخاب طول موج تشخیص
۴٫ تقویت سیگنال
۵٫ عدم نیاز به برچسب آنتی بادی اولیه خود
۵-۱٫ کاهش هزینه
۵-۲٫ عدم از دست دادن آنتی بادی های اولیه ارزشمند
۵-۳٫ بهبود نتایج

انتخاب یک آنتی بادی ثانویه صحیح برای تحقیقات شما برای نتایج قابل اعتماد و تکرارپذیر ضروری است. مهم است که یک آنتی بادی ثانویه را انتخاب کنید که به گونه های خاص، ایمونوگلوبولین هدف، کلاس یا زیر کلاس آنتی بادی اولیه که شما از آن استفاده می کنید، مرتبط است. همچنین بسته به روش شناسایی (detection) که مورد استفاده قرار می گیرد نوع کنژوگه (فلوئوروفور در برابر آنزیم) تعیین می شود. ابزار برگزیده آنتی بادی ثانویه Biorbyt به شما کمک خواهد کرد که بهترین انتخاب را برای نتایج بهینه داشته باشید.

مواردی که باید در انتخاب آنتی بادی ثانویه نظر گرفت:

– مجموع یا قطعه (F (ab ‘)2، Fab، Ig)
– گونه میزبان اولیه شما (خرگوش، مرغ، بز، موش، اسب و غیره)
– کلاس و زیر کلاس آنتی بادی اولیه (IgG / IgM، IgG1، IgG2a)
– سایر منابع ایمونوگلوبولین در آزمایش شما (بافر بلوک، IgG درون زاد)
– نوع برچسب/کنژوگه مورد نیاز

IgG کامل یا قطعه؟
به طور کلی، یک ایمونوگلوبولین کامل (به عنوان مثال IgG (H+L) می تواند به عنوان آنتی بادی ثانویه مورد استفاده قرار گیرد. اینها به زنجیره های سنگین و سبک ایمونوگلوبولین (IgG، IgM، IgA و غیره) متصل شده و بالاترین سیگنال را می دهند. گاهی اوقات بهتر است از یک قطعه استفاده کنید. استفاده از قطعه های تک ظرفیتی Fab می تواند به طور موثری برای جلوگیری از IgG درونزاد در بافت ها و شناسایی همزمان دو آنتی ژن با دو آنتی بادی اولیه که از یک گونه به دست آمده اند مورد استفاده قرار بگیرد (بعدا در این مورد بیشتر توضیح داده خواهد شد). قطعه F(ab’)2 با آنزیم برش داده شده اند تا دامنه Fc مولکول IgG حذف شود. استفاده ازاین مولکول ها در شرایطی توصیه می شود که اتصال کاذب به گیرنده های Fc در سطوح سلولی مانند سلول های B باعث ایجاد سیگنال کاذب و مشکل در فرآیند آزمایش می شود. آنها اغلب در آزمایش های فلوسیتومتری استفاده می شوند تا اطمینان حاصل شود که آنتی بادی ثانویه با دامنه Fc به سطح سلول متصل نیست.

گونه های میزبان آنتی بادی اولیه (host species)

گونه میزبان به گونه ای از حیوانات اشاره دارد که در آن آنتی بادی تولید شده است. آنتی بادی ثانویه شما باید علیه گونه میزبان آنتی بادی اولیه شما باشد. به عنوان مثال، اگر آنتی بادی اولیه شما در موش ایجاد شود، شما باید یک ضد موش را به عنوان ثانویه انتخاب کنید. مهم نیست که آنتی بادی ثانویه شما در چه نوع حیوانی ایجاد می شود، مگر اینکه آزمایش شناسایی هم زمان چند آنتی ژن مد نظر شما باشید، در این صورت تمام ثانویه هایی که استفاده می کنید باید در یک گونه میزبان ایجاد شوند.

کلاس آنتی بادی و زیر کلاس

یک آنتی بادی ثانویه را انتخاب کنید که کلاس و زیر کلاس آنتی بادی اولیه شما را هدف قرار دهد. آنتی بادیهای منوکلونال اولیه معمولا در موش یا خرگوش ایجاد میشوند و دارای یک زیرمجموعه خاص هستند. بنابراین، آنتی بادی ثانوی شما می تواند به طور خاص بر علیه زیر کلاس اولیه مونوکلونال شما قرار گیرد، به عنوان مثال IgG1. داشتن آنتی بادی های اولیه در کلاس های متعدد و در نتیجه آنتی بادی های ثانویه بر علیه آن ها که مختص کلاس خاصی از آنتی بادی اولیه هستند مشکلات مرتبط با شناسایی یک آنتی ژن با آنتی بادی های اولیه از یک میزبان را برطرف کند در صورتی که کلاس آنتی بادی های اولیه با وجود یکسان بودن میزبان متفاوت بوده و آنتی بادی های ثانویه نیز اختصاصی کلاس خاصی باشند. مثلا آنتی بادی های ضد IgG1 به IgG2a متصل نمی شود حتی اگر هر دو به طور مثال در میزبان خرگوش ایجاد شده باشند.
آنتی بادیهای پلی کلونال ممکن است متعلق به بیش از یک زیر کلاس باشند. بیشتر آنتی بادی های پلی کلونال معمولا ایزوتایپ IgG (زنجیره گاما گلوبولین) تولید شده در خرگوش است. بنابر این آنتی بادی ثانویه باید ضد IgG باشد و بتواند زنجیره سنگین و سبک را تشخیص دهد (anti-IgG H & L).

 

پیش جذب (preadsorption)

این امر برای از بین بردن واکنش متقاطع (cross-reaction) ناخواسته با ایمونوگلوبولینها مهم است، بنابراین باعث افزایش اختصاصیت و کاهش سیگنال پس زمینه می شود. بعضی از آنتی بادی های ثانویه جذب متقاطع شده اند، به طوری که در حین آزمایش سایر ایمونوگلوبولین ها را نمی شناسند و با آن ها واکنش نشان نمی دهند. این آنتی بادی ها برای زدودن هر گونه ایمونوگلوبولینی که به یک گونه خاص (گونه مد نظر برای حذف واکنش متقاطع) متصل می شوند، پاکسازی می شوند. این فرایند تولید آنتی بادی های بسیار اختصاصی را که واکنش متقابل با گونه های دیگر غیر از گونه مورد هدف ندارند را ممکن می کند.
یک مثال Rabbit anti-Mouse min x Rat است که با موش واکنش داده و با رت واکنش متقاطع ندارد.
تمام مولکولهای IgG که به IgG رت متصل می شوند، حذف شده اند، و تنها آنهایی باقی مانده اند که به طور ویژه به آنتی بادی موش متصل می شوند.

طیف کنژوگه های بیوربیت(Biorbyt):

برچسب ها شما را قادر به شناسایی پروتئین هدف می کنند. روش تشخیص و کاربردی که شما استفاده می کنید، گزینه های کنژوگه مورد نیاز شما را تعیین می کنند. بیوربیت هر دو آنتی بادی های ثانویه کونژوگه و غیر کنژوگه را عرضه می کند. کنژوگه های ما طیف وسیعی از بیشترین طول موج های فلورسانت و آنزیم ها را محدوده گسترده ای از گونه ها پوشش می دهد.
کنژوگه ها مولکول هایی هستند که می توانند به آنتی بادی ثانویه اضافه شوند تا برای تشخیص دادن مورد استفاده قرار گیرند. در صورت استفاده از فلوسیتومتری یا ایمونوفلورسانس/IHC فلورسنت و سایر روش های مبتنی بر فلوئوروفورها در آزمایش، انتخاب کنژوگه شما وابسته به روش تشخیص و دسترسی لیزر است. ایمونوفلورسانس و فلوسیتومتری نیاز به آنتی بادی هایی که به برچسب های نشانگر فلورسنت متصل هستند، به عنوان مثال Alexa Fluor، FITC، Qdot و غیره. الایزا و وسترن بلات می توانند بر پایه روش های رنگ سنجی، کمی(شیمی) لومینسانس و یا فلوئورسانت انجام شوند. در مواردی که این تست ها بر پایه روش کروموژنیک (رنگ سنجی) یا کمی لومینسانس انجام می شوند استفاده از کنژوگه هایی مانند پراکسیداز ریشه خردل (HRP) یا فسفاتاز قلیایی می تواند یک گزینه مناسب باشد.

 

 

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *